一、引言

基因治療作為一種潛力的治療手段，為多種難治性疾病，如遺傳性疾病、癌癥等帶來(lái)了新的希望。然而，基因傳遞的效率和安全性一直是限制基因治療廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題。在眾多基因傳遞載體中，陽(yáng)離子多聚物納米載體因其更好的優(yōu)勢(shì)受到了廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)的病毒載體雖然具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但存在免疫原性、潛在致瘤性等安全隱患。非病毒載體中的脂質(zhì)體等也有穩(wěn)定性和靶向性不足等問(wèn)題。陽(yáng)離子多聚物納米載體則有望結(jié)合兩者的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)合理的設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)高效、安全的基因傳遞。本研究旨在探索陽(yáng)離子多聚物納米載體的創(chuàng)新設(shè)計(jì)和優(yōu)化，為基因傳遞開(kāi)辟新的途徑。

二、材料與方法

（一）材料準(zhǔn)備

聚合物單體選擇

選擇具有良好生物相容性和可修飾性的陽(yáng)離子單體，如聚乙烯亞胺（PEI）衍生物、聚賴氨酸（PLL）等。同時(shí)，引入具有特定功能的共聚單體，如聚乙二醇（PEG）單體以提高載體的親水性和穩(wěn)定性，減少與血液成分的非特異性相互作用。這些單體均購(gòu)自專業(yè)的化學(xué)試劑供應(yīng)商，純度達(dá)到分析純以上。

其他試劑

交聯(lián)劑（如戊二醛等，根據(jù)聚合反應(yīng)類型選擇）用于在聚合過(guò)程中連接單體形成聚合物鏈。緩沖溶液（如磷酸鹽緩沖液 PBS）用于維持反應(yīng)體系的 pH 值穩(wěn)定，保證聚合反應(yīng)在適宜的條件下進(jìn)行。此外，還需要用于基因負(fù)載的質(zhì)粒 DNA，其編碼特定的報(bào)告基因（如綠色熒光蛋白 GFP）或治療相關(guān)基因，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的基因克隆和提取方法制備。

（二）陽(yáng)離子多聚物納米載體的合成

溶液聚合

將選定的陽(yáng)離子單體、共聚單體和交聯(lián)劑按一定比例溶解在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑（如二甲基亞砜 DMSO，根據(jù)單體溶解性選擇）或緩沖溶液中。在惰性氣體（如氮?dú)猓┍Ｗo(hù)下，通過(guò)加熱或添加引發(fā)劑（ AIBN）引發(fā)聚合反應(yīng)。反應(yīng)溫度和時(shí)間根據(jù)單體種類和反應(yīng)活性進(jìn)行優(yōu)化，一般溫度在 40 - 80℃之間，反應(yīng)時(shí)間從數(shù)小時(shí)到數(shù)十小時(shí)不等。例如，對(duì)于 PEI - PEG 共聚物的合成，將適量的 PEI 衍生物和 PEG 單體溶解在 PBS 中，在 60℃下反應(yīng) 24 小時(shí)，期間持續(xù)攪拌以保證反應(yīng)均勻進(jìn)行。

乳液聚合（針對(duì)特定體系）

對(duì)于一些難溶性單體或需要控制納米載體粒徑的情況，采用乳液聚合方法。將單體分散在水相或油相中（根據(jù)單體親疏水性），加入乳化劑（如十二烷基硫酸鈉 SDS）形成穩(wěn)定的乳液體系。然后在引發(fā)劑作用下進(jìn)行聚合反應(yīng)。例如，在制備含有疏水性功能基團(tuán)的陽(yáng)離子多聚物納米載體時(shí)，將疏水性單體和陽(yáng)離子單體溶解在油相中，加入 SDS 乳化后在水相中進(jìn)行聚合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)破乳、洗滌等步驟獲得納米載體。

（三）陽(yáng)離子多聚物納米載體的表征

粒徑和電位測(cè)定

使用動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS）測(cè)量納米載體在溶液中的粒徑分布。將合成的納米載體分散在 PBS 或其他合適的緩沖溶液中，在特定的溫度（通常為 25℃）下進(jìn)行測(cè)量。同時(shí)，利用 zeta 電位分析儀測(cè)量納米載體的表面電位，以評(píng)估其表面電荷性質(zhì)，這對(duì)于理解納米載體與基因及細(xì)胞的相互作用至關(guān)重要。

形態(tài)觀察

通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）觀察納米載體的形態(tài)。對(duì)于 TEM 觀察，將納米載體溶液滴在銅網(wǎng)上，經(jīng)過(guò)負(fù)染（如使用磷鎢酸溶液）處理后在電子顯微鏡下觀察。SEM 觀察則需要將納米載體溶液滴在硅片等基底上，干燥后進(jìn)行噴金處理，然后在 SEM 下觀察其表面和整體形態(tài)，確定納米載體是否呈規(guī)則的球形或其他預(yù)期的形狀。

聚合物結(jié)構(gòu)分析

采用傅里葉變換紅外光譜（FT - IR）和核磁共振（NMR）技術(shù)分析聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。FT - IR 可以識(shí)別聚合物中特定官能團(tuán)的存在，通過(guò)與單體的紅外光譜對(duì)比，確定聚合反應(yīng)是否成功以及是否引入了預(yù)期的功能基團(tuán)。NMR 則能更詳細(xì)地解析聚合物鏈的結(jié)構(gòu)，包括單體單元的連接方式、共聚比例等信息。例如，通過(guò)對(duì)合成的 PEI - PEG 共聚物進(jìn)行 1H - NMR 分析，可以準(zhǔn)確確定 PEI 和 PEG 單元在共聚物中的比例。

（四）體外基因傳遞效率評(píng)估

細(xì)胞培養(yǎng)

選擇多種與基因治療相關(guān)的細(xì)胞系，如人胚腎 293T 細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞等。將細(xì)胞培養(yǎng)在含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中，在 37℃、5% CO? 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

將合成的陽(yáng)離子多聚物納米載體與含有報(bào)告基因（如 GFP 基因）的質(zhì)粒 DNA 混合，在不同的質(zhì)量比（如載體：DNA 為 1:1、2:1、5:1 等）下孵育一定時(shí)間（一般為 15 - 30 分鐘），形成納米復(fù)合物。然后將納米復(fù)合物加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間（24 - 72 小時(shí)）。通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)熒光陽(yáng)性細(xì)胞的比例，以此評(píng)估基因轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步定量分析轉(zhuǎn)染效率，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分布，計(jì)算轉(zhuǎn)染細(xì)胞的百分比和平均熒光強(qiáng)度。

細(xì)胞毒性測(cè)定

在進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，評(píng)估陽(yáng)離子多聚物納米載體的細(xì)胞毒性。采用 MTT 法或 CCK - 8 法，在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（24、48、72 小時(shí)）檢測(cè)細(xì)胞的存活率。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞與 MTT 試劑或 CCK - 8 溶液孵育，然后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度值，與未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞比較，計(jì)算細(xì)胞存活率，確定納米載體在有效轉(zhuǎn)染基因的同時(shí)是否對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用。

（五）體內(nèi)基因傳遞效率評(píng)估

動(dòng)物模型建立

選擇合適的動(dòng)物模型，如小鼠模型。根據(jù)研究目的，可建立腫瘤模型（如通過(guò)皮下接種腫瘤細(xì)胞）或正常生理模型。對(duì)于腫瘤模型，待腫瘤生長(zhǎng)至一定大小（一般體積達(dá)到 50 - 100mm3）后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

體內(nèi)基因傳遞實(shí)驗(yàn)

將陽(yáng)離子多聚物納米載體與治療相關(guān)基因（如腫瘤抑制基因）的質(zhì)粒 DNA 形成的納米復(fù)合物通過(guò)尾靜脈注射或局部注射（針對(duì)腫瘤模型）等方式引入動(dòng)物體內(nèi)。在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)（如 24 小時(shí)、3 天、7 天等），采集組織樣本（包括腫瘤組織、肝臟、腎臟等主要器官）。通過(guò)定量 PCR 檢測(cè)組織中目的基因的表達(dá)水平，確定納米載體在體內(nèi)的基因傳遞效率。同時(shí)，利用免疫組化等方法觀察目的基因表達(dá)產(chǎn)物在組織中的定位和表達(dá)情況。

生物安全性評(píng)價(jià)

對(duì)注射納米復(fù)合物后的動(dòng)物進(jìn)行長(zhǎng)期觀察，評(píng)估其體重變化、飲食情況等一般生理指標(biāo)。采集血液樣本，檢測(cè)血常規(guī)、肝腎功能等生化指標(biāo)，確定納米載體是否對(duì)機(jī)體產(chǎn)生全身性的毒性作用。對(duì)主要器官（如心、肝、脾、肺、腎）進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，觀察是否有炎癥、壞死等病理變化，全面評(píng)價(jià)陽(yáng)離子多聚物納米載體在體內(nèi)的生物安全性。

三、結(jié)果

（一）陽(yáng)離子多聚物納米載體的合成與表征結(jié)果

通過(guò)溶液聚合或乳液聚合方法成功合成了一系列陽(yáng)離子多聚物納米載體。粒徑測(cè)量結(jié)果顯示，納米載體的粒徑分布在合適的范圍內(nèi)（例如 50 - 200nm），可以通過(guò)改變聚合條件和單體比例進(jìn)行調(diào)控。zeta 電位分析表明納米載體具有明顯的正電荷，有利于與帶負(fù)電荷的 DNA 結(jié)合。TEM 和 SEM 圖像顯示納米載體呈現(xiàn)出規(guī)則的球形或近似球形的形態(tài)。FT - IR 和 NMR 分析證實(shí)了預(yù)期的聚合物結(jié)構(gòu)，證明了共聚反應(yīng)的成功和功能基團(tuán)的引入。

（二）體外基因傳遞效率與細(xì)胞毒性結(jié)果

在體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，不同的陽(yáng)離子多聚物納米載體在一定的載體：DNA 質(zhì)量比下表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)染效率。部分優(yōu)化后的納米載體在 293T 細(xì)胞和 HeLa 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到與陽(yáng)性對(duì)照（如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑）相近的水平。同時(shí)，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，這些納米載體在有效轉(zhuǎn)染基因的濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞的存活率影響較小，MTT 和 CCK - 8 檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞存活率均在 80% 以上，說(shuō)明具有較好的生物相容性。

（三）體內(nèi)基因傳遞效率與生物安全性結(jié)果

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)尾靜脈注射納米復(fù)合物后，在腫瘤組織和部分正常組織中檢測(cè)到了目的基因的表達(dá)。定量 PCR 結(jié)果顯示，在腫瘤組織中目的基因的表達(dá)水平在注射后一定時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)出明顯的升高趨勢(shì)。免疫組化結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了目的基因表達(dá)產(chǎn)物在腫瘤細(xì)胞中的定位。對(duì)動(dòng)物的長(zhǎng)期觀察和生化指標(biāo)檢測(cè)、組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，陽(yáng)離子多聚物納米載體未引起明顯的體重變化、血液生化指標(biāo)異常和器官病理?yè)p傷，具有良好的體內(nèi)生物安全性。

四、討論

（一）陽(yáng)離子多聚物納米載體設(shè)計(jì)與合成的優(yōu)化

本研究中，通過(guò)對(duì)單體選擇、聚合反應(yīng)條件的優(yōu)化成功合成了具有理想性能的陽(yáng)離子多聚物納米載體。引入 PEG 等共聚單體有效地改善了納米載體的親水性和穩(wěn)定性，減少了在體內(nèi)循環(huán)過(guò)程中的非特異性吸附。同時(shí)，不同的聚合方法為納米載體的粒徑和形態(tài)控制提供了多種途徑。然而，在合成過(guò)程中，仍需要進(jìn)一步探索更精準(zhǔn)的聚合反應(yīng)控制方法，以實(shí)現(xiàn)更窄的粒徑分布和更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

（二）體外與體內(nèi)基因傳遞效率的影響因素

在體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，載體：DNA 質(zhì)量比是影響轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵因素之一。合適的質(zhì)量比能夠保證納米復(fù)合物的形成和有效進(jìn)入細(xì)胞。細(xì)胞類型也對(duì)轉(zhuǎn)染效率有顯著影響，不同細(xì)胞對(duì)納米載體的攝取機(jī)制和內(nèi)吞效率存在差異。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，納米載體的粒徑、表面電荷以及給藥途徑等因素決定了其在體內(nèi)的分布和基因傳遞效率。例如，較小的粒徑有利于納米載體通過(guò)毛細(xì)血管壁進(jìn)入組織，而局部注射可以提高在腫瘤組織等特定部位的基因傳遞效果。

（三）生物安全性的重要性和進(jìn)一步評(píng)估

陽(yáng)離子多聚物納米載體的生物安全性是其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵前提。本研究通過(guò)多種方法初步證實(shí)了其在體內(nèi)的安全性，但長(zhǎng)期和更深入的安全性評(píng)估仍需進(jìn)一步開(kāi)展。例如，需要研究納米載體在體內(nèi)的代謝途徑和清除機(jī)制，以及是否會(huì)引起慢性炎癥或免疫反應(yīng)等潛在問(wèn)題。此外，對(duì)于不同劑量和長(zhǎng)期使用情況下的安全性評(píng)價(jià)也需要進(jìn)一步完善。

五、結(jié)論

本研究成功開(kāi)發(fā)了創(chuàng)新的陽(yáng)離子多聚物納米載體，并通過(guò)全面的實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了表征、體外和體內(nèi)基因傳遞效率評(píng)估以及生物安全性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，這些納米載體在基因傳遞方面具有較高的潛力，能夠在一定程度上克服傳統(tǒng)基因傳遞載體的局限性。雖然還存在一些需要改進(jìn)和深入研究的問(wèn)題，但本研究為陽(yáng)離子多聚物納米載體在基因治療領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展提供了有價(jià)值的參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為未來(lái)基因治療載體的優(yōu)化和臨床應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。隨著研究的不斷深入，有望開(kāi)發(fā)出更高效、更安全的陽(yáng)離子多聚物納米載體，推動(dòng)基因治療技術(shù)的發(fā)展，為更多患者帶來(lái)福音。