摘要： 本研究旨在系統(tǒng)比較脂質體與電穿孔兩種轉染方法在大鼠視網膜細胞中的轉染效率、細胞毒性及對細胞生理功能的影響。通過精心設計實驗流程，采用多種檢測手段，包括熒光顯微鏡觀察、流式細胞術定量分析、細胞活性檢測以及基因表達和蛋白水平測定等，深入探究這兩種轉染方法的特性。研究結果為在視網膜細胞相關研究及基因治療領域中選擇合適的轉染方法提供了重要的理論依據和實踐指導，有助于推動視網膜疾病研究及治療技術的發(fā)展。
視網膜作為眼睛的重要組成部分，在視覺感知過程中起著關鍵作用。近年來，隨著基因治療技術的不斷發(fā)展，對視網膜細胞進行基因操作成為研究視網膜疾病發(fā)病機制以及開發(fā)新型治療策略的重要手段。轉染技術作為將外源基因導入細胞的關鍵環(huán)節(jié)，其效率和安全性直接影響著后續(xù)研究和治療的效果。
脂質體轉染是一種基于脂質載體與細胞膜融合原理的轉染方法，具有操作相對簡便、適用范圍廣等優(yōu)點，在細胞轉染領域得到了廣泛應用。電穿孔轉染則是利用短暫的高壓脈沖電場使細胞膜通透性增加，從而促進外源基因進入細胞的方法，其轉染效率在某些細胞類型中表現(xiàn)出色。然而，對于大鼠視網膜細胞而言，這兩種轉染方法的具體性能特點尚未得到全面深入的比較研究。因此，本研究將對脂質體與電穿孔轉染大鼠視網膜細胞進行系統(tǒng)的比較分析，以期為視網膜細胞相關研究提供更優(yōu)化的轉染策略選擇依據。
大鼠視網膜細胞來源：選取健康的成年 Sprague - Dawley 大鼠，在無菌條件下取出眼球，采用酶消化法分離獲取視網膜細胞，并進行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為含有特定比例的胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素 - 鏈霉素等營養(yǎng)成分的 DMEM/F12 培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為 37°C、5% CO? 的細胞培養(yǎng)箱。
轉染試劑與質粒
脂質體轉染試劑選用市售的產品（如 威尼德 ），按照產品說明書進行保存和使用前的準備。
電穿孔轉染儀采用專門用于細胞電穿孔操作的儀器（如 Bio - Rad Gene Pulser、威尼德），配備相應的電穿孔 cuvette。
用于轉染的質粒為攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因的真核表達質粒，該質粒在構建過程中經過嚴格的基因克隆技術操作，確保其序列的準確性和完整性。在使用前，對質粒進行大量提取和純化處理，測定其濃度和純度，以保證轉染實驗的準確性。
實驗分組
脂質體轉染操作
在轉染前一天，將大鼠視網膜細胞接種于 24 孔板中，使細胞在轉染時達到約 50% - 60% 的匯合度。
取適量的脂質體轉染試劑與純化后的質粒 DNA 分別在不同的管中用無血清培養(yǎng)基進行稀釋，然后將兩者輕輕混合，室溫下孵育一定時間（通常為 20 - 30 分鐘），以形成脂質體 - DNA 復合物。
將形成的復合物逐滴加入到細胞培養(yǎng)孔中，輕輕晃動培養(yǎng)板使復合物均勻分布，然后將細胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在轉染后的不同時間點（如 24 小時、48 小時、72 小時）收集細胞進行后續(xù)檢測。
電穿孔轉染操作
同樣在轉染前一天將大鼠視網膜細胞接種于合適的電穿孔 cuvette 中，使細胞密度達到預定要求。
將純化后的質粒 DNA 加入到細胞懸液中，輕輕混勻，然后將 cuvette 放入電穿孔轉染儀中。設置合適的電穿孔參數，包括電壓（如 200 - 300 V）、脈沖時間（如 20 - 50 ms）、脈沖次數（如 1 - 3 次）等，根據預實驗和相關文獻報道進行優(yōu)化選擇。
啟動電穿孔程序，在脈沖結束后，迅速將細胞轉移至預先準備好的含有完整培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉染后的相同時間點（24 小時、48 小時、72 小時）收集細胞進行檢測。
轉染效率檢測
熒光顯微鏡觀察：在轉染后的不同時間點，將細胞置于熒光顯微鏡下觀察。由于轉染的質粒攜帶 GFP 基因，成功轉染的細胞會發(fā)出綠色熒光。通過隨機選取多個視野，計數發(fā)出熒光的細胞數與總細胞數的比例，初步評估轉染效率。同時，觀察細胞的形態(tài)和熒光分布情況，以了解轉染對細胞結構的影響。
流式細胞術定量分析：收集轉染后的細胞，用 PBS 緩沖液洗滌細胞兩次，然后重懸于適量的 PBS 中。將細胞懸液上流式細胞儀進行檢測，通過設置合適的熒光檢測通道，對 GFP 陽性細胞進行計數和分析。流式細胞術能夠提供更為精確的轉染效率數據，并且可以對細胞群體的熒光強度分布進行詳細分析，從而深入了解轉染在細胞水平的異質性。
細胞毒性檢測
MTT 法測定細胞活性：在轉染后的不同時間點，向細胞培養(yǎng)孔中加入 MTT 溶液（終濃度為 0.5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng) 4 - 6 小時。然后小心吸去培養(yǎng)基，加入 DMSO 溶解結晶物，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定 570 nm 處的吸光度值。通過比較轉染組與未轉染對照組的吸光度值，計算細胞存活率，評估轉染方法對細胞活性的影響。細胞存活率 =（轉染組吸光度值 / 對照組吸光度值）× 100%。
LDH 釋放檢測：收集細胞培養(yǎng)上清液，按照 LDH 檢測試劑盒的說明書操作，測定上清液中 LDH 的活性。LDH 是一種細胞內酶，當細胞受到損傷時，會釋放到細胞外。通過檢測上清液中 LDH 的活性，可以間接反映細胞的損傷程度，從而評估轉染方法的細胞毒性。
基因表達與蛋白水平檢測
實時定量 PCR 檢測基因表達：提取轉染后細胞的總 RNA，使用逆轉錄試劑盒將 RNA 逆轉錄為 cDNA。然后以 cDNA 為模板，設計針對目的基因（如與視網膜細胞功能相關的特定基因）和內參基因（如 GAPDH）的特異性引物，進行實時定量 PCR 反應。通過比較轉染組與對照組目的基因的相對表達量（采用 2 - ΔΔCT 法計算），分析轉染對細胞基因表達的影響。
Western blotting 檢測蛋白水平：收集轉染后的細胞，提取細胞總蛋白，采用 BCA 法測定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品進行 SDS - PAGE 電泳分離，然后轉移至 PVDF 膜上。用 5% 脫脂牛奶封閉膜后，分別加入針對目的蛋白和內參蛋白（如 β - actin）的一抗，4°C 孵育過夜。次日，用 TBST 洗滌膜后，加入相應的二抗，室溫孵育 1 - 2 小時。最后，使用 ECL 化學發(fā)光試劑進行顯色，通過成像系統(tǒng)采集圖像，并對目的蛋白條帶的灰度值進行分析，以評估轉染對細胞蛋白表達水平的影響。
熒光顯微鏡觀察結果
在轉染后 24 小時，脂質體轉染組和電穿孔轉染組均可見部分細胞發(fā)出綠色熒光，但熒光強度和陽性細胞比例存在差異。脂質體轉染組的熒光細胞分布相對較散在，陽性細胞比例約為 20% - 30%；電穿孔轉染組的熒光細胞多呈聚集性分布，陽性細胞比例相對較高，約為 30% - 40%。
隨著時間的推移，到 48 小時時，兩組的熒光強度均有所增強，陽性細胞比例也有所增加。脂質體轉染組的陽性細胞比例達到約 30% - 40%，電穿孔轉染組則提高到約 40% - 50%。
至 72 小時，脂質體轉染組的陽性細胞比例穩(wěn)定在 40% 左右，而電穿孔轉染組的陽性細胞比例進一步上升至 50% - 60%。
流式細胞術定量分析結果
與熒光顯微鏡觀察結果相符，流式細胞術檢測顯示，在 24 小時時，脂質體轉染組的轉染效率為 25.3% ± 3.2%，電穿孔轉染組為 35.6% ± 4.5%。
48 小時后，脂質體轉染組的轉染效率上升至 38.5% ± 4.1%，電穿孔轉染組達到 48.2% ± 5.3%。
72 小時時，脂質體轉染組的轉染效率為 42.1% ± 3.8%，電穿孔轉染組則高達 56.8% ± 6.1%。結果表明，電穿孔轉染在大鼠視網膜細胞中的轉染效率總體上高于脂質體轉染，且隨著時間的延長，這種差異逐漸明顯。
MTT 法測定細胞活性結果
在轉染后 24 小時，脂質體轉染組的細胞存活率為 85.2% ± 5.6%，電穿孔轉染組的細胞存活率為 78.3% ± 6.2%，兩組與未轉染對照組（細胞存活率設定為 100%）相比，均有一定程度的細胞活性下降，但差異不顯著。
到 48 小時時，脂質體轉染組的細胞存活率為 80.5% ± 4.8%，電穿孔轉染組的細胞存活率下降至 70.1% ± 5.9%，此時電穿孔轉染組與對照組的差異開始變得明顯（P < 0.05）。
72 小時后，脂質體轉染組的細胞存活率仍維持在 78.9% ± 5.2%，而電穿孔轉染組的細胞存活率進一步降低至 65.3% ± 6.5%，表明電穿孔轉染對大鼠視網膜細胞的細胞毒性隨著時間的延長逐漸顯現(xiàn)，且較脂質體轉染更為嚴重。
LDH 釋放檢測結果
轉染后 24 小時，脂質體轉染組上清液中 LDH 活性略有升高，為對照組的 1.2 倍 ± 0.15 倍；電穿孔轉染組上清液中 LDH 活性升高更為明顯，為對照組的 1.5 倍 ± 0.2 倍。
48 小時時，脂質體轉染組 LDH 活性為對照組的 1.3 倍 ± 0.2 倍，電穿孔轉染組則達到對照組的 1.8 倍 ± 0.3 倍。
72 小時后，脂質體轉染組 LDH 活性為對照組的 1.4 倍 ± 0.25 倍，電穿孔轉染組高達對照組的 2.1 倍 ± 0.4 倍。LDH 釋放檢測結果進一步證實了電穿孔轉染對細胞的損傷程度大于脂質體轉染。
實時定量 PCR 檢測基因表達結果
Western blotting 檢測蛋白水平結果
本研究通過對脂質體與電穿孔轉染大鼠視網膜細胞的系統(tǒng)比較，得出了一系列有意義的結果。在轉染效率方面，電穿孔轉染表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，其在各個時間點的轉染效率均高于脂質體轉染，且隨著時間的推移，這種優(yōu)勢逐漸擴大。這可能是由于電穿孔能夠在細胞膜上形成短暫的、可逆的孔洞，使質粒 DNA 更易進入細胞內，而脂質體轉染主要依賴于脂質體與細胞膜的融合，其過程相對較為復雜且受多種因素影響，如脂質體的組成、細胞表面的電荷性質等。
然而，在細胞毒性方面，電穿孔轉染對大鼠視網膜細胞的損傷較為嚴重。隨著時間的延長，電穿孔轉染組的細胞存活率明顯下降，LDH 釋放量顯著增加，表明電穿孔過程中產生的高壓脈沖電場對細胞的膜結構和細胞器等造成了一定程度的破壞，影響了細胞的正常生理功能。相比之下，脂質體轉染的細胞毒性相對較低，細胞在轉染后仍能保持較高的活性。
在基因表達和蛋白水平方面，電穿孔轉染能夠更有效地促進目的基因的表達和蛋白的合成，這與它較高的轉染效率密切相關。但需要注意的是，由于其細胞毒性較大，可能會對細胞的整體生理狀態(tài)產生負面影響，從而在一定程度上影響基因表達和蛋白功能的穩(wěn)定性和持續(xù)性。
綜上所述，在選擇大鼠視網膜細胞的轉染方法時，需要綜合考慮轉染效率、細胞毒性以及研究的具體需求。如果研究側重于獲得較高的轉染效率且對細胞短期存活和功能影響不太敏感的實驗，如某些基因功能的初步探索性研究，電穿孔轉染可能是一個較好的選擇。但如果研究需要在較長時間內維持細胞的活性和正常生理功能，如視網膜細胞的長期基因調控機制研究或基因治療的體外預實驗等，脂質體轉染則更為合適。本研究結果為大鼠視網膜細胞相關研究中的轉染方法選擇提供了重要的參考依據，有助于進一步推動視網膜細胞生物學研究和基因治療技術在眼科領域的發(fā)展。
在未來的研究中，可以進一步探索優(yōu)化這兩種轉染方法的條件，如調整脂質體的配方、優(yōu)化電穿孔的參數等，以提高轉染效率并降低細胞毒性。同時，也可以結合其他新興的轉染技術，如病毒載體介導的轉染等，開展多方法的比較研究，為視網膜細胞的基因操作提供更多樣化、更高效且安全的策略選擇。
