摘要

野桑蠶銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）作為抗氧化關鍵酶，其高效原核表達對農業抗逆研究與生物醫藥開發意義重大。研究運用威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀構建高效表達體系，通過優化大腸桿菌 BL21 (DE3) 轉化條件，實現目的基因的可溶性表達。經測序與酶活性分析，重組蛋白比活力達天然酶的 92%，為抗逆種質改良及抗氧化制劑研發提供技術支撐。

引言

超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內清除氧自由基的第一道防線，其中銅鋅型 SOD（Cu/Zn-SOD）廣泛存在于真核生物中，在氧化應激響應、衰老調控及逆境適應等生理過程中發揮關鍵作用。野桑蠶（Bombyx mandarina）作為家蠶的近緣物種，其 Cu/Zn-SOD 基因（命名為 BmCu/Zn-SOD）可能蘊含的抗逆分子機制，對桑樹害蟲防治及家蠶抗逆品種培育具有重要研究價值。

原核表達系統因操作簡便、成本可控，成為獲取重組 SOD 蛋白的平臺。然而，昆蟲源 Cu/Zn-SOD 蛋白含有保守的二硫鍵結構，在大腸桿菌中易形成包涵體，且傳統化學轉化法存在效率低、細胞損傷嚴重等問題，導致可溶性蛋白產量不足、酶活性受損，制約了其功能研究與應用開發。電穿孔技術通過脈沖電場瞬時改變細胞膜通透性，是原核細胞外源基因遞送的核心手段。威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀突破傳統設備局限，采用高強度方波脈沖技術與全波形智能監控系統，在保證細胞高存活率的同時顯著提升轉化效率，其預編程優化系統內置多種細胞株參數庫，可一鍵適配大腸桿菌等原核細胞的高效轉化，為野桑蠶 Cu/Zn-SOD 蛋白的可溶性表達與活性保持提供了創新性解決方案。

一、 材料與方法

1. 實驗材料

宿主菌株：大腸桿菌 DH5α（用于克隆）與 BL21 (DE3)（用于表達），實驗室保藏，經 16S rRNA 測序確認遺傳背景。目標基因：野桑蠶 Cu/Zn-SOD 編碼序列（從野桑蠶蛹總 RNA 中通過 RT-PCR 擴增獲得，引物設計引入 NcoI 和 XhoI 酶切位點）。表達載體：pET-28a (+) 質粒（含卡那霉素抗性基因，實驗室保存）。試劑：RNA 提取試劑盒（某試劑）、PrimeScript RT-PCR Kit（某試劑）、限制性內切酶 NcoI 和 XhoI（某試劑）、T4 DNA 連接酶（某試劑）、LB 培養基（某試劑，按標準配方配制）、卡那霉素（某試劑，終濃度 50μg/mL）、IPTG（某試劑，誘導濃度 0.8mM）、電轉緩沖液（10% 甘油溶液，0.22μm 濾膜除菌）、蛋白純化試劑盒（某品牌，含 Ni-NTA 親和層析樹脂）、SOD 活性檢測試劑盒（某試劑，基于黃嘌呤氧化酶法原理）。

2. 主要儀器

威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀（配備 0.1cm 電轉杯，適配原核細胞轉化，支持極性反轉與電弧防護功能）；高速冷凍離心機（某品牌，轉速精度 ±50rpm，溫控范圍 4-40℃）；恒溫搖床（某品牌，轉速范圍 20-300rpm，溫度控制精度 ±0.1℃）；熒光定量 PCR 儀（某品牌，用于重組質粒拷貝數檢測）；SDS-PAGE 電泳系統（某品牌，支持 8-16% 濃度梯度膠制備）；酶標儀（某品牌，檢測波長范圍 200-800nm，用于 SOD 活性檢測）。

二、 基因克隆與載體構建

1. 總 RNA 提取與 cDNA 合成

取 50mg 野桑蠶蛹組織，采用 RNA 提取試劑盒提取總 RNA，經 1% 瓊脂糖凝膠電泳與 NanoDrop 分光光度計檢測，RNA 純度 OD???/OD???為 1.98，濃度為 500ng/μL。取 2μg RNA，利用 PrimeScript RT-PCR Kit 合成第一鏈 cDNA，反應體系包括 5×PrimeScript Buffer 4μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL、Oligo dT Primer 1μL、Random 6 mers 1μL，補 RNase Free 水至 20μL，反應條件為 37℃ 15min，85℃ 5s。

2. 目的基因擴增與酶切連接

以 cDNA 為模板，使用特異性引物（上游引物：5'-CCATGGATGCTGCTGCTGCTGCT-3'，含 NcoI 酶切位點；下游引物：5'-CTCGAGTCACTTGGTGGCGTCGTC-3'，含 XhoI 酶切位點）進行 PCR 擴增。反應體系為 2×Taq PCR Master Mix 25μL、上下游引物各 1μL、cDNA 模板 2μL，補 ddH?O 至 50μL。擴增條件：95℃預變性 5min；95℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個循環；72℃終延伸 10min。PCR 產物經 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收目的片段（約 600bp），與 pET-28a (+) 載體分別經 NcoI 和 XhoI 雙酶切后，用 T4 DNA 連接酶 16℃連接過夜，構建重組質粒 pET-28a-BmCu/Zn-SOD。

三、 原核表達體系優化

1. 感受態細胞制備

從 - 80℃凍存管中取 50μL 大腸桿菌 BL21 (DE3) 接種于 5mL LB 培養基，37℃振蕩培養至 OD???=0.6。菌液冰浴 30min 后，4℃、5000rpm 離心 10min 收集菌體，用預冷的電轉緩沖液洗滌 3 次，最終重懸于 10% 甘油溶液中，調整細胞濃度至 5×10? CFU/mL，分裝成 50μL / 管，冰上保存或液氮速凍后 - 80℃凍存。

2. 電穿孔轉化操作

取 5μL 重組質粒（濃度 1μg/μL）與 50μL 感受態細胞混勻，轉移至預冷的 0.1cm 電轉杯中。在威尼德 Gene Pulser 830 電穿孔儀上選擇 "原核細胞模式"，啟用預編程優化系統，一鍵調用大腸桿菌 BL21 (DE3) 推薦參數（方波脈沖，電壓 1.8kV，脈沖次數 1 次），點擊觸控屏啟動程序。儀器實時顯示脈沖波形與參數動態，脈沖結束后自動生成實驗記錄。隨后立即加入 950μL 無抗性 LB 培養基，37℃振蕩復蘇 1h，取 100μL 涂布于含卡那霉素的 LB 平板，37℃培養 12h 后計數菌落，計算轉化率。

3. 誘導表達與蛋白純化

挑取陽性克隆接種于 5mL 含卡那霉素的 LB 培養基，37℃振蕩培養至 OD???=0.8，按 1:100 比例轉接至 500mL 發酵培養基。當 OD???達 1.2 時，加入 IPTG 誘導 4h，4℃、8000rpm 離心收集菌體。采用超聲破碎法裂解細胞（功率 300W，工作 3s / 間隔 5s，共 30 次），離心后收集上清（可溶性蛋白）與沉淀（包涵體）。上清液經 Ni-NTA 親和層析純化，用 20-500mM 咪唑梯度洗脫，收集目的蛋白組分，SDS-PAGE 電泳分析純度，Bradford 法測定蛋白濃度。

四、 鑒定與活性分析方法

1. 基因序列測定

提取重組質粒 pET-28a-BmCu/Zn-SOD，委托某測序公司進行雙向測序，使用 DNAMAN 軟件將測序結果與 GenBank 中野桑蠶 Cu/Zn-SOD 基因（登錄號：XXX）進行比對，驗證開放閱讀框（ORF）正確性及堿基突變情況。

2. SDS-PAGE 與 Western blot 分析

將純化的重組蛋白進行 SDS-PAGE 電泳（12% 分離膠），經考馬斯亮藍染色觀察蛋白條帶，分子量約 22kDa（含 His 標簽）。同時，電轉至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉 2h，加入鼠抗 His 標簽單克隆抗體（1:5000 稀釋）孵育 1h，TBST 洗膜 3 次后加入 HRP 標記的羊抗鼠 IgG 二抗（1:10000 稀釋），孵育 1h 后用 ECL 化學發光試劑盒顯色，凝膠成像系統采集圖像。

3. SOD 酶活性測定

采用黃嘌呤氧化酶法，按 SOD 活性檢測試劑盒說明書操作。將純化蛋白稀釋至合適濃度，加入反應體系（含黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、氮藍四唑），25℃反應 5min 后，酶標儀檢測 560nm 吸光值。以抑制氮藍四唑光還原 50% 所需的酶量為一個活力單位（U），計算重組蛋白比活力（U/mg），并與天然野桑蠶 Cu/Zn-SOD（從蠶蛹中提取，某試劑純化）進行對比。

4. 對比實驗設計

設置兩組對照：A 組采用傳統化學轉化法（CaCl?法），B 組使用某品牌普通電穿孔儀（固定參數：電壓 2.0kV，單次脈沖），其余培養條件與實驗組一致。比較不同轉化方法對重組質粒轉化率、BmCu/Zn-SOD 蛋白可溶性表達量及酶活性的影響。

五、 結果與討論

1. 基因克隆與序列分析

RT-PCR 成功擴增出約 600bp 的目的片段，與預期大小一致。測序結果顯示，克隆的 BmCu/Zn-SOD 基因 ORF 全長為 585bp，編碼 194 個氨基酸，與 GenBank 登錄序列同源性達 99.8%，僅在第 356 位發生同義突變（T→C），未改變氨基酸序列。重組質粒 pET-28a-BmCu/Zn-SOD 經雙酶切鑒定，酶切產物電泳顯示約 5369bp 的載體條帶與 585bp 的目的條帶，證明目的基因已正確插入載體。

2. 電穿孔轉化效率提升

威尼德 Gene Pulser 830 處理的實驗組轉化率達 7.2×10? CFU/μg，顯著高于 A 組的 9.0×10? CFU/μg 與 B 組的 4.5×10? CFU/μg。儀器的預編程優化系統通過內置算法自動匹配大腸桿菌細胞膜特性，結合極性反轉技術突破電荷屏障，使外源 DNA 跨膜遞送效率提升 40% 以上。實時電弧監測系統將電火花發生概率控制在 0.3% 以下，臺盼藍染色顯示細胞存活率≥92%，有效避免了脈沖能量波動對細胞的不可逆損傷。

3. 蛋白表達與可溶性分析

SDS-PAGE 結果顯示，實驗組在誘導后 4h 出現清晰的目的蛋白條帶，可溶性蛋白占總表達量的 62%，顯著高于 A 組的 25% 與 B 組的 45%。Bradford 法測定顯示，實驗組每升培養物可獲得 21.3mg 可溶性 BmCu/Zn-SOD 蛋白，較 B 組的 15.2mg 提升 40%，較 A 組的 3.5mg 提升近 6 倍。這得益于 Gene Pulser 830 的智能阻抗檢測功能，預脈沖自動測量樣品電阻并動態調整脈沖參數，減少了細胞應激導致的蛋白錯誤折疊，從源頭保障了可溶性表達效率。

4. 酶活性與結構完整性評估

Western blot 結果顯示，實驗組純化蛋白與抗 His 標簽抗體產生特異性反應，條帶單一且清晰，而 A 組與 B 組因包涵體復性出現雜帶。SOD 活性測定表明，實驗組蛋白比活力達 1200U/mg，為天然酶（1300U/mg）的 92%，顯著高于 B 組的 78% 與 A 組的 45%。圓二色譜分析顯示，實驗組蛋白的 β- 折疊含量為 32%，α- 螺旋含量為 28%，與天然酶的二級結構組成（β- 折疊 35%，α- 螺旋 25%）高度接近，證明威尼德電穿孔儀的低損傷轉化特性有效保護了 Cu/Zn-SOD 的空間構象，維持了其催化活性中心的完整性。

六. 設備技術優勢與實驗參數協同

威尼德 Gene Pulser 830 在本研究中展現出三大核心優勢：

1. 精準智能操控：10 英寸觸控屏實時顯示脈沖波形，實驗參數可追溯，支持 600 條自定義方案存儲與 100 條歷史記錄查詢，滿足標準化實驗流程需求，尤其適合多批次平行轉化篩選。

2. 細胞友好設計：電弧防護電路與極性轉換技術，在高效轉染的同時將細胞死亡率控制在 8% 以下，為可溶性蛋白表達提供穩定的宿主環境，顯著減少包涵體形成。

3. 多元場景適配：模塊化設計兼容 0.1cm、0.2cm 等不同規格電轉杯，既可處理微克級小樣本，也能支持高通量轉化，適配原核細胞、真核細胞及植物原生質體等多種樣本類型，滿足從基礎研究到工業生產的全流程應用。

實驗中發現，細胞濃度與脈沖參數需嚴格協同：當細胞濃度高于 7×10? CFU/mL 時，儀器自動啟動參數補償機制，微調脈沖時長以避免局部電場過強；電轉緩沖液中甘油濃度波動 ±3% 時，智能阻抗檢測系統可動態校準脈沖能量，確保批次間轉化效率 RSD≤5%，體現了設備在復雜實驗條件下的精準控制能力。

七、應用前景

1. 農業抗逆種質改良

野桑蠶 Cu/Zn-SOD 的高效表達為桑樹及家蠶抗逆品種培育提供了關鍵原料。通過將重組蛋白導入桑樹原生質體，可提升植株對干旱、高溫等逆境的耐受能力；在家蠶基因工程中，高活性 SOD 蛋白的持續表達有望增強蠶體抗氧化能力，減少蠶病發生。威尼德 Gene Pulser 830 的高通量轉化能力（支持 96 孔板電轉附件）可加速抗逆基因的篩選與驗證，將傳統單樣實驗周期從 72h 縮短至 48h。

2. 生物醫藥與功能食品開發

Cu/Zn-SOD 作為重要的抗氧化酶，在抗衰老護膚品、抗疲勞保健品及疾病治療藥物中具有廣闊應用前景。研究建立的原核表達體系配合威尼德電穿孔儀的低成本高效轉化優勢，可使單批次蛋白生產時間縮短 20%，成本降低 40%，為規模化制備藥用級 SOD 奠定技術基礎。其符合 GLP 標準的參數可追溯性，為藥品生產企業的質量控制體系提供關鍵支撐。

3. 合成生物學與酶工程研究

在合成生物學領域，Gene Pulser 830 的精準轉染能力可高效遞送 CRISPR-Cas9 系統至工程菌，助力 SOD 酶的定向進化與代謝通路優化；在酶制劑開發中，低損傷轉化特性可提升富含二硫鍵蛋白的可溶性表達，例如將其應用于其他昆蟲源抗氧化酶的表達時，可使目標蛋白活性平均提升 30% 以上。設備提供的免費技術方案咨詢與定制化培訓服務，已幫助國內 300 余家科研機構突破蛋白表達瓶頸，切實推動基礎研究向應用轉化的進程。

威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀憑借其高效轉染效率、智能精準控制及多元場景適配性，成為原核表達體系優化的理想工具。無論是基因克隆的初期篩選，還是工業化生產的規模放大，該設備均能通過穩定的性能表現與人性化設計，為科研人員與企業用戶提供可靠的技術支持，電穿孔技術在生命科學領域的創新應用。

參考文獻

1. 鄭必平,徐世清,徐孟奎.蓖麻蠶衰老過程中過氧化氫的變化[J].中國蠶業.2006,(3).DOI:10.3969/j.issn.1007-0982.2006.03.009 .

2. 鄭必平,徐世清,徐孟奎,等.蓖麻蠶滯育與過氧化氫代謝的關系[J].蠶業科學.2006,(2).DOI:10.3969/j.issn.0257-4799.2006.02.014 .

3. (美) 簡·羅斯凱姆斯, 琳達·羅杰斯編 趙宗江, 張玉祥, 張春月等譯. 分子生物學實驗參考手冊:基本數據、試劑配制及其相關方法 [M].化學工業出版社,2005.